T 0060/89 (Protéines de fusion) 31-08-1990

Motifs de la décision

1. Le recours est recevable.

2. Requête principale

2.1. Modifications (article 123(2) et (3) CBE)

Les revendications 2 et 7 de la requête principale ont un libellé différent des revendications 2 et 7 telles que rejetées par la division d'opposition, dans la mesure où elles précisent que le fragment d'ADN non bactérien a été fusionné, extrémité contre extrémité, avec le gène bactérien à l'intérieur de la partie de ce gène codant la séquence de tête hydrophobe de la protéine bactérienne ou une partie de celle-ci, de façon à ce que la protéine ou le polypeptide déterminé soit sécrété à travers une membrane de cellule bactérienne. La signification de l'expression "une" membrane est étayée par le contenu de la description dans son ensemble, qui ne se réfère pas uniquement à une certaine membrane interne ou externe d'une certaine bactérie, mais plutôt aux deux types de membranes ; autrement dit, c'est la sécrétion dans l'espace périplasmatique et dans le milieu extracellulaire qui est décrit ; en outre, d'après la description, on peut utiliser non seulement une souche bactérienne particulière, mais également d'autres souches tout aussi appropriées. Etant donné qu'il ressort également de la divulgation initiale et des revendications du brevet tel que délivré que les protéines sont sécrétées à travers "une" membrane, par exemple lorsqu'il est dit qu'"un" hôte bactérien est transformé avec le gène recombiné, le texte modifié des revendications 2 et 7 de la requête principale est admissible au regard des conditions exigées à l'article 123(2) et (3) CBE.

2.2. Exposé suffisant de l'invention dans les revendications 2 et 7 (article 83 CBE)

2.2.1. Le procédé selon la revendication 2 décrit une "fusion parfaite" entre la partie d'un gène bactérien destiné à coder la séquence de tête hydrophobe d'une protéine porteuse extracellulaire ou périplasmatique ou d'une partie de celle-ci et un fragment d'ADN non bactérien codant pour la protéine ou le polypeptide déterminé. Cette approche générale est décrite de façon plus détaillée à la colonne 8, par exemple de la manière suivante : "le segment d'ADN du gène de pénicillinase situé entre le code d'acide aminé 23 à l'extrémité de la séquence de tête hydrophobe et le code d'acide aminé 45 à la coupure Taq peut être éliminé en grignotant l'ADN à l'aide d'un mélange d'enzymes appropriées, par exemple l'exonucléase lambda qui grignotera le brin d'ADN à partir de l'extrémité 5', associée à l'enzyme S1 qui éliminera le brin saillant. Un autre mélange de ce genre est proposé : la polymérase ADN T4 qui grignotera l'extrémité 3' d'un brin d'ADN, associée à l'enzyme S1 qui, là encore, éliminera le brin saillant. Par une digestion contrôlée, la molécule d'ADN du plasmide peut être convenablement raccourcie au fragment s'étendant de la coupure R1 au point codant pour l'acide aminé 23 ou à d'autres points de la séquence de tête hydrophobe ; un tel fragment peut être fusionné avec un fragment généré de la même façon et contenant la séquence d'insuline, et grignoté à l'aide d'enzymes jusqu'à un point initial approprié, probablement encore le point où commence la molécule d'insuline mature. Ces deux fragments peuvent être fusionnés entre eux, par exemple, par ligature des bouts par la ligase ADN T4 et ce produit de la fusion peut être inséré dans le plasmide". A la colonne 8, il est encore dit que "bien qu'une telle construction puisse en principe être réalisée avec exactitude, dans la pratique elle le serait probablement sur une base aléatoire, ce qui implique l'épissage de toute une série de fragments de gènes dont les points extrêmes se trouvent dans des régions intéressantes".

2.2.2. Lorsque l'on considère la question de savoir si un homme du métier de compétence moyenne aurait été en mesure, à la date de priorité du brevet litigieux, de mettre en oeuvre le procédé selon la revendication 2 en se fondant sur la description figurant à la colonne 8, il semble nécessaire de définir l'homme du métier et les connaissances générales de base dans le domaine du génie génétique en 1978. Il convient d'examiner si les informations données à la colonne 8 peuvent être considérées comme un exemple de réalisation. En outre, il faut déterminer si l'homme du métier n'aurait pas pu tirer de ses connaissances générales de base des variantes de tous les moyens spécifiques décrits à la colonne 8, qui lui auraient permis de reproduire le procédé selon la revendication 2, conformément à l'enseignement général de la colonne 8.

2.2.3. En ce qui concerne la question de l'"exemple de réalisation" soulevée ci-dessus, l'utilisation dans le texte de la description figurant à la colonne 8 de termes tels que "vraisemblablement", "probablement", "sera" et "en principe", indique que les travaux décrits n'ont pas encore été réalisés.

Il est donc difficile de considérer les informations figurant à la colonne 8 comme un exemple de réalisation. La Chambre juge convaincants les arguments avancés par les intimés selon lesquels l'homme du métier aurait échoué s'il avait procédé en suivant exactement les informations plutôt vagues fournies à la colonne 8 comme exemple de réalisation, en y consacrant un temps et des recherches raisonnables. Les intimés ont souligné qu'en particulier en 1978, le clivage du gène de pénicillinase avec l'enzyme de restriction Taq aurait produit sept fragments et qu'à l'époque, il aurait été extrêmement difficile de traiter ce problème. Par ailleurs, le contrôle des enzymes grignotant l'ADN n'était pas encore suffisamment développé, de sorte qu'il aurait été très difficile d'arrêter le mélange de réaction exactement au point où il était nécessaire de former une fusion parfaite. La solution proposée à la colonne 8 n'aurait donc pas permis à un homme du métier suivant à la lettre cette partie de la description de mettre en oeuvre le procédé selon la revendication 2 sans effort excessif, si tant est qu'il ait pu y parvenir.

2.2.4. Pour répondre à la question de savoir s'il existait ou non des variantes des moyens et des étapes de procédé mentionnés à la colonne 8, qui étaient connues de l'homme du métier et qui auraient permis à ce dernier de mettre en oeuvre l'invention conformément à la revendication 2, il faut rechercher quelles étaient les connaissances générales de base accessibles à l'époque à l'homme du métier. Il semble que le gène de pénicillinase dans le plasmide pBR322 était connu et que des enzymes de restriction étaient disponibles sur le marché. En outre, on connaissait des exonucléases qui grignotent l'ADN, une fois celui-ci coupé par une enzyme de restriction. Toutefois, la Chambre souscrit aux arguments des intimés selon lesquels, par exemple, le remplacement de l'enzyme de restriction Taq, apparemment inappropriée pour mettre en oeuvre l'invention, par une autre enzyme de restriction plus adaptée, à savoir l'enzyme PvuI que les requérants ont utilisée lors de l'expérience décrite dans leurs conclusions supplémentaires, ne constituait pas une variante que l'homme du métier pouvait tirer des connaissances générales de base. Les intimés ont précisé, au cours de la procédure orale, que, bien que l'enzyme de restriction PvuI ait été disponible en tant que telle, l'homme du métier ne l'aurait pas utilisée parce que la carte de restriction connue et publiée du plasmide pBR322 n'indiquait pas le site de clivage de cette enzyme de restriction. On ne peut donc pas raisonnablement supposer que l'homme du métier aurait utilisé l'enzyme de restriction susmentionnée, même si l'on est d'accord avec les requérants lorsqu'ils affirment que dans toute expérience de ce genre, les scientifiques utilisent une batterie d'enzymes de restriction pour déterminer quelles sont les plus convenables. Dans ces conditions, il semble qu'il aurait été bien improbable que l'homme du métier choisisse une enzyme de restriction dont les caractéristiques de clivage n'étaient pas connues, qu'il s'agisse du nombre ou de la situation des sites. Le choix de l'enzyme de restriction convenable dans chaque cas nécessite de larges compétences et ne va pas sans tâtonnements. La Chambre est d'avis que l'homme du métier dans le domaine du génie génétique en 1978 ne saurait être défini comme un lauréat du prix Nobel, même si un certain nombre de scientifiques travaillant dans ce domaine à l'époque se sont effectivement vu attribuer le prix Nobel. Il faut plutôt considérer comme homme du métier un scientifique titulaire d'un diplôme universitaire ou une équipe de scientifiques de ce niveau, travaillant dans des laboratoires qui à cette époque ont évolué de la génétique moléculaire aux techniques du génie génétique.

2.2.5. En outre, dans l'expérience présentée par les requérants, le procédé de grignotage des fragments d'ADN respectifs pour une quantité précisément définie de paires de base a là encore été mis en oeuvre avec des exonucléases différentes de celles indiquées à la colonne 8. Ceci montre une fois de plus que des connaissances supérieures à celle d'un scientifique de compétence moyenne sont nécessaires pour choisir un mélange d'exonucléases qui ramène à un niveau raisonnable le nombre d'expériences aléatoires permettant de produire exactement les fragments d'ADN désirés, et pouvant être considérées comme des expériences de routine dans ce domaine et à cette époque.

2.2.6. Une autre étape, nécessaire à l'obtention d'une "fusion parfaite", est décrite dans l'expérience. Il s'agit de la préparation de deux fragments différents du plasmide, l'un contenant la séquence de tête hydrophobe bactérienne qui doit être grignotée pour éliminer exactement 348 paires de base et le second comprenant la séquence de tête de proinsuline qui doit être grignotée pour éliminer exactement 209 paires de base. Ces fragments doivent ensuite être à nouveau ligaturés au reste du plasmide afin de réaliser le plasmide "de fusion parfaite". Ceci est nécessaire, parce que la distance à grignoter à partir du point initial du site de clivage de PvuI est différente dans chacune des deux directions, et qu'un seul essai ne suffit pas pour y parvenir. Concernant cette étape, il y a apparemment une lacune dans la description de la colonne 8 et la Chambre est d'avis qu'à la date de priorité, en 1978, les connaissances générales de base ne permettaient pas de combler cette lacune.

2.2.7. Dans la décision T 292/85 (JO OEB 1989, 275), la Chambre avait conclu qu'il n'est pas nécessaire, pour qu'un procédé revendiqué soit exposé de manière suffisante, que chaque variante puisse être mise en oeuvre, dès lors que l'homme du métier connaît des variantes appropriées grâce à ses connaissances générales de base. Dans la présente espèce, les connaissances générales de base ne permettaient pas de trouver des variantes convenables pour mettre en oeuvre le procédé proposé à la colonne 8 et il n'était pas probable qu'un homme du métier aurait réussi à reproduire le procédé selon la revendication 2 en se conformant exactement aux indications contenues dans la colonne 8. La revendication 2 n'est donc pas admissible en vertu de l'article 83 CBE.

Le produit revendiqué dans la revendication 7 correspond au procédé selon la revendication 2, dans la mesure où il représente une étape de ce procédé. Le raisonnement concernant l'inadmissibilité de la revendication 2, fondé sur les dispositions de l'article 83 CBE, s'applique également à la revendication 7.

La requête principale, qui contient les revendications non admissibles 2 et 7, doit donc être rejetée.

3. Requête subsidiaire

3.1 Nouveauté (Article 54 CBE)

3.1.1. Concernant la conférence donnée en juin 1978 par le professeur Gilbert à l'université de Chicago, les intimés ont déclaré, après avoir tenu compte des conclusions présentées par les requérants au cours de la procédure orale, qu'ils ne mettaient pas en doute cette information. Cependant, de l'avis de la Chambre, le journal ne clarifiait pas définitivement la question de la date. La Chambre estime que dans une situation comme celle-ci, où les faits en cause se sont produits il y a douze ans, où la procédure d'opposition a été engagée il y a six ans déjà, et où, en outre, la question n'est pas poursuivie par les parties, elle n'est plus tenue d'examiner cette situation d'office, comme le prévoit l'article 114(1) CBE. C'est pourquoi la Chambre considère que ladite conférence faite à l'université de Chicago ne détruit pas la nouveauté du brevet attaqué.

3.1.2. La même conclusion s'applique à la conférence faite par M. Sutcliffe lors du colloque de Cold Spring Harbor avant la date de priorité du brevet litigieux. Au cours de la procédure orale devant la division d'opposition, le titulaire du brevet a produit une déclaration de l'un des inventeurs, le professeur Gilbert, indiquant qu'il était improbable qu'une conférence donnée par un membre de son laboratoire à l'université de Harvard, M. Sutcliffe, ait décrit les travaux du groupe du professeur Gilbert sur l'expression et la sécrétion de la proinsuline du rat. En réalité, le thème de la conférence faite par M. Sutcliffe était le séquencement nucléotidique complet du plasmide pBR322. Ce qui porte également à croire que M. Sutcliffe ne traitait pas de l'objet du brevet litigieux, est le fait que ce dernier, sachant que le professeur Gilbert se préparait à faire connaître lui-même ses travaux sur la proinsuline du rat à Chicago au début du mois de juin, n'en aurait pas parlé en premier. Ces déclarations ont été réitérées au cours de la procédure orale, et il a été ajouté que M. Sutcliffe ne travaillait pas sur la proinsuline du rat.

Bien que le document (a), en tant que tel, aurait fourni des indications sur le thème du colloque de Cold Spring Harbor, la Chambre considère, tout bien pesé et en l'absence de toute autre preuve, que ce colloque ne détruit pas la nouveauté de l'invention.

La revendication 1 de la requête subsidiaire est donc nouvelle.

3.2. Activité inventive (Article 56 CBE)

3.2.1. Pour examiner le problème à la base du brevet litigieux, la Chambre considère que le document (h) constitue l'état de la technique le plus proche. Ce document décrit des travaux de recherche effectués dans le même domaine technique que celui dont traite le brevet litigieux. Dans le document (h), un gène de somatostatine, un peptide de mammifère avec 14 restes d'acides aminés, a été entièrement synthétisé par des procédés chimiques. Ce gène a ensuite été fusionné avec un gène ß-galactosidase d'une bactérie, Escherichia coli, dans le plasmide pBR322. L'expression à l'intérieur d'une cellule bactérienne de ce gène fusionné a conduit à la synthèse d'un polypeptide contenant la séquence d'acides aminés correspondant à la somatostatine. Après avoir été séparée de la cellule bactérienne, la protéine chimère de grande taille a été clivée afin de produire de la somatostatine active. Ces résultats ont représenté le premier succès dans la réalisation de l'expression (c'est-à-dire la transcription en ARN et la traduction de cet ARN en une protéine d'une séquence d'acide aminé désirée) d'un gène obtenu par synthèse chimique. La molécule produite semble être relativement résistante à une activité protéolytique endogène. Ce procédé protège apparemment de la dégradation de nombreuses protéines dans E.coli, qu'il s'agisse d'enzymes de grande taille ou de polypeptides de plus petite taille, qui seraient sinon indétectables pour cette raison. La protéine hétérologue, exprimée et produite comme protéine de fusion, doit être séparée des cellules bactériennes. D'après le document (h), ceci est effectué en détruisant les cellules bactériennes et en isolant la protéine désirée des débris cellulaires.

3.2.2. Au cours de la procédure, les requérants ont souligné les inconvénients du procédé connu d'isolation des protéines hétérologues. Comme l'a exposé de manière convaincante le professeur Gilbert, la principale difficulté que soulève la purification de la protéine désirée après la destruction de la cellule bactérienne, est la contamination par des centaines d'autres protéines contenues dans la cellule bactérienne. Partant du document (h), on peut donc considérer que le problème que le brevet litigieux se propose de résoudre consiste à améliorer l'isolation de protéines hétérologues exprimées dans une cellule hôte.

3.2.3. Ce problème est résolu par le brevet de la façon décrite dans la revendication 1, à savoir en fusionnant par recombinaison le gène hétérologue et un gène bactérien codant une portion d'une protéine porteuse extracellulaire ou périplasmatique bactérienne, de manière à ce que la protéine fusionnée soit sécrétée à travers une membrane de la cellule à l'intérieur de laquelle elle est produite naturellement, et de telle sorte que la protéine ou le polypeptide de fusion déterminé sécrété puisse être séparé du milieu extracellulaire. L'exemple décrit dans le brevet litigieux fournit la preuve que le problème a été effectivement résolu par les titulaires du brevet. En tout état de cause, le caractère suffisant de la divulgation de la revendication 1 et de la partie correspondante de la description n'a jamais été contesté par les intimés.

3.2.4. Le procédé revendiqué présente des avantages par rapport à l'état de la technique le plus proche décrit dans le document (h), car non seulement il assure la stabilité de la protéine hétérologue désirée à l'intérieur de la cellule, comme le procédé décrit dans le document (h), mais il transporte en outre la protéine désirée jusqu'à la membrane de la cellule et à travers celle-ci, la séquence de tête de la protéine bactérienne étant tout d'abord séparée de la protéine de fusion par des enzymes bactériennes présentes dans les membranes bactériennes et la récupération de la protéine désirée étant ensuite facilitée par le fait que le nombre de protéines sécrétées dans le milieu entourant la cellule a considérablement diminué par rapport à la totalité des protéines rencontrées dans une cellule bactérienne. Le procédé selon la revendication 1 constitue donc un développement ingénieux du procédé décrit dans le document (h).

3.2.5. La question est de savoir si, à partir du document (h), ce procédé était évident pour l'homme du métier eu égard aux connaissances divulguées par les documents (c), (d) ou (f). Il semble que les connaissances divulguées par ces documents fournissent un outil pour mettre en oeuvre le procédé revendiqué. Toutefois, de l'avis de la Chambre, cela ne signifie pas nécessairement que l'utilisation de cet outil dans un procédé décrit ailleurs rend évident l'ensemble du procédé.

La Chambre estime qu'il convient de se fonder sur le même niveau de connaissances lorsque, pour la même invention, on doit apprécier à la fois la question du caractère suffisant de l'exposé et celle de l'activité inventive. Comme cela a été souligné plus haut au point 2.2.4, ce n'est pas le niveau de connaissances d'un lauréat du prix Nobel qui définit l'homme du métier, et, par là-même, ce qui doit être considéré comme faisant partie des connaissances générales de base à cette époque. On peut supposer que l'homme du métier, tel que défini plus haut (cf. point 2.2.4), confronté à ce problème, connaissait l'existence des séquences de tête dans les systèmes de cellules eucaryotes et l'hypothèse signal dans les systèmes bactériens. Il se peut également qu'il ait eu connaissance des documents (c), (d) et (f) d'où il ressortait que l'hypothèse signal pouvait aussi valoir pour les protéines bactériennes. Il convient de mentionner ici que, bien que lesdits documents décrivent des protéines qui sont transportées vers la membrane, apparemment par des séquences de tête, ces protéines ne sont pas sécrétées à travers la membrane vers la zone entourant celle-ci, mais sont plutôt des composants de la membrane elle-même, même si elles sont localisées avec leurs éléments fonctionnels à la surface extérieure de la membrane. Pour parvenir au procédé selon la revendication 1, en se fondant sur toutes les connaissances mentionnées, il a fallu tout d'abord imaginer que la fusion de la protéine hétérologue avec les séquences de tête d'une protéine bactérienne présenterait les avantages mentionnés ; on ne trouve aucune proposition à ce sujet dans aucun des documents de l'état de la technique ; en second lieu, il a fallu choisir une protéine bactérienne convenable ayant une séquence de tête. La question clé est donc de savoir s'il était évident pour l'homme du métier d'essayer de mettre en oeuvre l'idée exposée ci-dessus avec une espérance de réussite raisonnable.

3.2.6. Comme il a été indiqué plus haut au paragraphe 2.2, la Chambre est d'avis que les connaissances générales de base à la date de priorité ne permettaient pas de savoir dans le détail quelles étaient les étapes et les variantes nécessaires pour mettre en oeuvre le procédé selon la revendication 2, conformément aux informations données à la colonne 8. Si l'on appliquait ici les mêmes principes, il faudrait disposer de compétences dépassant les connaissances générales de base ; le nombre d'essais qu'aurait dû effectuer l'homme du métier à l'époque pour combiner le procédé décrit dans le document (h) avec l'un des documents décrivant l'existence et la fonction de séquences de tête bactériennes aurait été excessif. L'utilisation d'outils connus dans une combinaison appropriée en vue de mettre en oeuvre un nouveau procédé ne rend pas nécessairement ce procédé évident.

3.2.7. Cette opinion est confirmée par le fait qu'aucun des documents de l'état de la technique ne donne d'informations quant à la manière d'isoler des protéines hétérologues de cellules hôtes autrement que par destruction des cellules. Comme l'a souligné le professeur Gilbert au cours de la procédure orale, il n'existe actuellement que deux variantes : soit lyser ou rompre les cellules et séparer la protéine désirée des débris cellulaires ; soit fusionner la protéine hétérologue avec une protéine bactérienne ayant une séquence de tête, la protéine désirée étant sécrétée activement à travers la membrane dans l'espace entourant la cellule bactérienne, avec tous les avantages mentionnés plus haut.

Pour les raisons susindiquées, le procédé selon la revendication 1 implique une activité inventive.

Les revendications 2 à 8 de la requête subsidiaire se rapportent à certains modes de réalisation préférés et ne soulèvent aucune objection.